2×Universal Blue SYBR Green QPCR Master Mix (cu UDG)

 

Numele produsului	Pisică. Nu.	Spec.
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (cu UDG)	G3328-01	1 ml
	G3328-05	5×1 ml
	G3328-15	15×1 ml

 

 

Acest produs este un premix specializat 2x pentru reacțiile qPCR folosind metoda fluorescenței himerice SYBR Green I. Utilizarea Taq ADN-polimerazei incluse în anticorpi în combinație cu UDG (Uracil-DNA Glycosylase) și dUTP reduce eficient formarea dimerilor de primer, sporește specificitatea și îmbunătățește sensibilitatea pe de o parte și previne contaminarea încrucișată cauzată de produsele de amplificare PCR. pe de altă parte, rezultând o cuantificare mai precisă a genei țintă. Între timp, acest produs conține colorant special de referință ROX pasiv și colorant de urmărire a spiking de vizualizare albastră, care poate fi aplicat la toate instrumentele qPCR, fără a fi necesară ajustarea concentrației ROX pe diferite instrumente. Este furnizat și diluantul de șablon galben. Când șablonul este diluat cu diluantul de șablon galben și adăugat la premixul de reacție albastru, culoarea se schimbă de la albastru la verde, ceea ce poate juca un rol de urmărire în procesul de pregătire a sistemului de reacție, prevenind omisiunea sau adăugarea greșită. Spectrele acestui colorant albastru și galben nu se suprapun cu colorantul qPCR și nu afectează rezultatele reacției.

 

 

Navă cu gheață umedă; depozitați la -20 grade ferit de lumină, valabil 12 luni.

 

Numărul componentei	Componentă	G3328-01	G3328-05	G3328-15
G3328-1	2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (cu UDG)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
G3328-2	40×Tampon de diluție șablon galben	1 ml	1 ml	1 ml
Manual		1 exemplar

 

 

1. (Opțional) Diluare șablon

Tamponul de probă galben este furnizat la o concentrație de 40X pentru diluarea șablonului ADN, care poate determina cu precizie dacă șablonul a fost adăugat la soluția de reacție qPCR prin schimbarea culorii lichidului. Luând ca exemplu sistemul de reacție qPCR de 20 μL, în funcție de cantitatea de șablon de diluție adăugată în soluția de reacție qPCR de 20 μL, metoda de diluare corespunzătoare a șablonului original poate fi referită la următorul tabel (luând șablonul original diluat la 100 μL ca un exemplu):

Adăugați șablonul diluat la soluția de reacție qPCR de 20 μL (μL)	1	2	3	4	5	6	7	8
Adăugați tamponul de diluție al șablonului 40x GALBEN la sistemul de diluare al șablonului de 100 μL (μL)	50	25	16.7	12.5	10	8.4	7.2	6.3
Adăugați sistemul de diluare a șablonului de 100μL la șablonul primar (μL)	x	x	x	x	x	x	x	x
Volumul de adăugare a nucleazei - apă liberă (μL)	50-x	75-x	83.3-x	87.5-x	90-x	91.6-x	92.8-x	93.7-x

 

De exemplu: 2 μL șablon diluat trebuie adăugat la sistemul de reacție qPCR de 20 μL. Luând ca exemplu sistemul de diluare a șablonului de 100μL. Dacă volumul original al șablonului este de 20μL, se adaugă 25μL 40x Yellow Template Dilution Buffer, apoi se adaugă apă fără nucleaze 55μL la volumul total de 100μL. Tamponul de diluție al șablonului GALBEN de 40x este acum de 10x. Adăugați 2μL de șablon diluat într-un sistem de reacție qPCR de 20-μL și concentrația finală a tamponului de diluare a șablonului GALBEN 40× este de 1x.

Notă: Dacă concentrația șablonului este prea mică, nu este nevoie să diluați sau nu doriți să utilizați șablonul diluat cu tampon de diluare a șablonului 40x YELLOW, puteți omite acest pas.

1. 2. Sistem de reacție qPCR recomandat:

Componentă	20 μL rxn	50 μL rxn	Concentrarea finală
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (cu UDG)	10 μL	25 μL	1×
Forward Primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Primer invers (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Templateb	Variabilă	Variabilă	după cum este necesar
Apă fără nucleaze	Adăugați la 20 μL	Adăugați la 50 μL

 

a: De obicei, se poate obține un efect de amplificare bun cu concentrația finală de {{0}},2 μM. Când performanța reacției este slabă, concentrația primerului poate fi ajustată în intervalul 0.2-1,0 μM.

b: Cantitatea de șablon adăugată variază în funcție de numărul de copii ale genei țintă, iar cantitatea adecvată de adăugare de șablon este studiată prin diluare cu gradient. Cea mai bună cantitate de adăugare de ADN șablon în sistemul de reacție de 20 μL a fost mai mică de 100 ng. Când cADN-ul (soluție de reacție RT) a reacției RT-PCR a fost utilizat ca șablon, cantitatea de adăugare nu trebuie să depășească 10% din volumul final de qPCR.

 

2. 3. Program de reacție PCR (poate fi ajustat corespunzător în funcție de instrumente):

A. Metoda în două etape					B. Metoda în trei etape
etapă	pas	Numărul ciclului	Temp eratura	timp	etapă	pas	Numărul ciclului	Temp eratura	timp
Etapa 1	Incubarea UDG	1	50 de grade	2 min	Etapa 1	Incubarea UDG	1	50 de grade	2 min
Etapa 2	predegenerare	1	95 de grade	30 sec	Etapa 2	Predeg generare	1	95 de grade	30 sec
Etapa 3	denaturare	40	95 de grade	15 sec	Etapa 3	denaturare	40	95 de grade	15 sec
	Recoacerea /extensie		60 de grade	30 sec		Recoacerea		55-65 grad	10 sec
						Extensie		72 de grade	30 sec
Etapa 4	Curba de topire	1	Instrument setare implicită		Etapa 4	Curba de topire	1	Instrument setare implicită

 

a: Dacă specificitatea de amplificare trebuie îmbunătățită, poate fi utilizată procedura în două etape sau temperatura de recoacere; Pentru a îmbunătăți eficiența amplificării, poate fi utilizată o procedură în trei pași sau un timp de prelungire.

 

 

1. Dacă nu este necesară urmărirea pipetei, șablonul diluat cu tamponul de diluție pentru șablon galben de 40× poate fi omis.

2. Vă rugăm să amestecați reactivii înainte de utilizare, răsturnându-i ușor în sus și în jos. Nu agitați și nu agitați pentru a evita bulele.

3. Reactivii trebuie plasați pe gheață atunci când se prepară amestecurile de reacție.

4. Lumina puternică trebuie evitată atunci când se prepară amestecuri de reacție PCR datorită colorantului fluorescent SYBR Green.

5. Trebuie folosite vârfuri noi de unică folosință pentru prepararea amestecurilor de reacție pentru a evita contaminarea încrucișată

6. Evitați ciclurile de îngheț-dezghețare ale Master Mix-ului și încercați să îl utilizați în decurs de o lună de la decongelare.

 

 

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, Seria QuantStudio™, PikoRealTM Cycler.

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™,

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QPCR

Cefeid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: seria Rotor-Gene®;

Roche: Seria LightCycler™;

Takara: seria Thermal Cycler Dice;

Analiză: seria qTOWER;

Hangzhou Bori: departamentul LineGene;

 

 

1. Se recomandă ca lungimea produsului amplificat să fie între 80-300 bp;

2. Lungimea primerului: 18-25 bp;

3. Păstrați conținutul G＋C în intervalul de 40%-60%.

4. Este de preferat ca valorile Tm ale primerului direct și invers să nu difere cu mai mult de 2 grade și este mai bine să controlați valoarea Tm la 58-62 grade;

5. Aleatorietatea distribuției de bază;

6. Nu ar trebui să existe mai mult de patru baze complementare sau omoloage între cei doi primeri, altfel se va forma un dimer de primer, iar suprapunerea complementară la capătul 3' trebuie evitată în special;

7. Se recomandă ca baza de capăt 3' a primerului să fie G sau C;

8. Nu apar produse nespecifice pe explozia NCBI.

 

 

Descrierea problemei	Motive posibile	Soluții
La sfârșitul reacției, nu a apărut nicio curbă de amplificare sau valoarea CT a apărut prea târziu	Concentrația șablonului este prea mică	Repetați experimentul pentru a reduce multiplu de diluție a șablonului și începeți de la cea mai mare concentrație atunci când concentrația probei este necunoscută
	Degradarea șablonului	Șablonul a fost pregătit din nou și experimentul a fost repetat
	Există inhibitori PCR în sistem	În general, șablonul este transportat, raportul de diluție al șablonului este crescut sau șablonul cu puritate ridicată este repreparat și repetat.
	Primerii se pot degrada	Primerii care nu au fost utilizați de mult timp ar trebui mai întâi testați pentru integritate prin electroforeză PAGE pentru a exclude posibilitatea degradării
	Eficiență scăzută de amplificare	Creșteți concentrația primerului, încercați o procedură de amplificare în trei etape sau reproiectați primerul
	Produsul de amplificare este prea lung	Lungimea produsului de amplificare a fost controlată în intervalul de 80-300 bp
Controlul gol arată semnalul	Poluarea sistemului de reacție	În primul rând, apa de control goală trebuie înlocuită. Dacă se întâmplă în continuare aceeași situație, amorsele, aspiratoarele și tuburile PCR trebuie înlocuite sau trebuie pornit un nou Master Mix. Sistemul de reacție este pregătit într-o masă super curată pentru a reduce poluarea cu aerosoli
	Apare o amplificare nespecifică, cum ar fi dimerii de primer	În general, este normal ca produsele de amplificare să apară în martor după 35 de cicluri, care ar trebui analizate cu curba de topire. Reproiectați primerul, ajustați concentrația primerului sau optimizați procedura de reacție PCR
Curba de topire are mai multe vârfuri	Designul grundului este slab	Noul grund a fost reproiectat conform principiilor de proiectare a grundului
	Concentrația primerului este prea mare	Reduceți concentrația de primer în mod corespunzător
	Există contaminare genomică în șablonul de ADNc	Soluția de ARN extrasă este digerată folosind enzime ADN, cum ar fi dsDNase, pentru a elimina contaminarea genomică sau pentru a proiecta primeri transintron.
Reproductibilitatea slabă a experimentelor	Eroarea de adăugare a probei este mare	Utilizarea unei pipete precise, cu o pipetă precisă a capului de aspirație de înaltă calitate; Șablon de diluție mare, adăugând șablon de volum mare pentru a reduce eroarea de eșantionare; Volumul de reacție al qPCR a fost mărit
	Concentrația șablonului este prea mică	Repetați experimentul pentru a reduce timpii de diluare a șablonului
	Abaterea temperaturii în diferite locații ale instrumentului qPCR	Calibrați instrumentul qPCR în mod regulat
Curba de amplificare nu este netedă	Semnalul de fluorescență este prea slab, produs după corectarea sistemului	Asigurați-vă că coloranții preamestecați în Master Mix nu sunt degradați; Înlocuiți semnalul fluorescent pentru a colecta consumabile qPCR mai bune
Curba de amplificare se rupe sau alunecă	Concentrația șablonului a fost mai mare și valoarea finală inițială a fost mai mare decât valoarea CT	Punctul final de referință (valoarea Ct -3) a fost redus și datele au fost reanalizate
Curbele de amplificare ale Wells individuale au scăzut brusc brusc	Există bule în tubul de reacție	Asigurați-vă că MIX este complet dizolvat și nu se rotește și nu oscilează uniform; După ce proba este adăugată, bulele sunt îndepărtate prin centrifugare cu elastic ușor. Timpul de pre-denaturare a fost extins la 10 min pentru a îndepărta bulele

 

Numai pentru cercetare!

 

 

Tag-uri populare: 2×universal blue sybr green qpcr master mix (cu udg), China 2×universal blue sybr green qpcr master mix (cu udg) producători, furnizori, fabrică